Isolement photodégradable à base d’hydrogel de colonies bactériennes dans des réseaux de micropuits

Résumé

Source : Fattahi, N., et al. Interfaces hydrogel photodégradables pour le dépistage, la sélection et l’isolement des bactéries. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo démontre l’utilisation d’hydrogels photodégradables pour isoler les colonies bactériennes dans les réseaux de micropuits en silicium. Les cellules bactériennes sont d’abord chargées dans des micropuits, encapsulées dans un hydrogel réticulé et cultivées en colonies distinctes. Lors de l’exposition à la lumière ultraviolette, la dégradation ciblée de l’hydrogel permet l’extraction sélective des colonies individuelles.

Protocole

1. Souches bactériennes et protocoles de culture

1. Striez les colonies de bactéries sur des plaques de gélose complétées par un milieu de croissance approprié. Dans le présent rapport, Bacillus subtilis (souche 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) est cultivé sur ATGN (0,079 M KH₂PO₄, 0,015 M (NH₄)₂SO₄, 0,6 mM MgSO₄·7H₂O, 0,06 mM CaCl₂·2H₂O, 0,0071 mM MnSO₄·H₂O, 0,125 M FeSO_4·7H₂O, 28 mM de glucose, pH : 7 ± 0,2, 15 g/L de gélose) sur des plaques de gélose complétée par 100 μg/mL de spectinomycine et d’Escherichia coli (souche 25922, ATCC) sur des plaques de gélose ATGN complétées par 100 μg/mL d’ampicilline.
   REMARQUE : Rapports antérieurs d’encapsulation et de libération d’hydrogel avec ces matériaux au lieu de cellules A. tumefaciens C58 utilisées
2. Prélever les colonies souhaitées dans les plaques de gélose ATGN et commencer les cultures pendant la nuit. Pour les souches d’E. coli et de B. subtilis utilisées ici, cultiver à 37 °C en agitant à 215 tr/min dans un milieu liquide ATGN pendant 24 h. Conservez les cultures cellulaires dans du glycérol à 50 % à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
3. Prélever des colonies des deux souches dans les stocks de glycérol à l’aide de boucles d’inoculation stériles et incuber dans un milieu liquide ATGN pendant 24 h à 37 °C et 215 tr/min.

2. Préparation du matériau nécessaire à la formation de l’hydrogel

1. Synthèse du diacrylate de poly(éthylène glycol)-o-nitrobenzyle photodégradable (PEG-o-NB-diacrylate)
   REMARQUE : La synthèse interne du diacrylate de PEG-o-NB a été bien décrite et précédemment rapportée. Alternativement, comme la synthèse est de routine, elle peut être externalisée à partir d’une installation de synthèse chimique.
2. Tampon de réticulation
   1. Prenez la recette du milieu sélectionné pour la souche bactérienne et préparez un milieu avec 2x nutriments. Ajouter du phosphate, par exemple NaH₂PO_4, au milieu jusqu’à une concentration finale de 100 mM. Ensuite, ajustez la valeur du pH à 8 en utilisant 5 M de NaOH (aq).
   2. Stérilisez la solution tampon et conservez-la à -20 °C jusqu’à ce qu’elle soit utilisée ultérieurement.
      REMARQUE : Laissez de côté les métaux de transition présents dans le milieu, car ces métaux catalysent l’oxydation des thiols en disulfures.
3. Solution de diacrylate de PEG-o-NB
   1. Pour chaque mg de poudre de diacrylate de PEG-o-NB aliquote (poids moléculaire de 3 400 Da), ajoutez 3,08 μL d’eau ultrapure pour atteindre une concentration de 49 mM de diacrylate de PEG-o-NB (concentration d’acrylate de 98 mM).
   2. Agitez la solution jusqu’à ce qu’elle soit bien mélangée et conservez cette solution à -20 °C jusqu’à ce qu’elle soit utilisée ultérieurement.
4. Solution de PEG-thiol à 4 bras
   1. Pour une préparation de PEG-thiol à 4 bras (poids moléculaire de 10 000 Da), ajouter 4 μL d’eau ultrapure par mg de poudre pour atteindre une concentration de 20 mM (80 mM de concentration de thiol).
   2. Vortex cette solution jusqu’à ce qu’elle soit bien mélangée et conservez-la à -20 °C jusqu’à ce qu’elle soit utilisée à nouveau.

5. Fabrication de réseaux de micropuits en silicium Revêtement

en

1. parylène : Utilisez le protocole standard décrit dans des articles de recherche précédents pour enrober les plaquettes de silicium de parylène.
2. Microfabrication : Suivez le protocole décrit dans la littérature pour concevoir et fabriquer le réseau de micropuits (Figure 1).
   REMARQUE : Des techniques photolithographiques standard ont été appliquées pour fabriquer des réseaux de micropuits sur des plaquettes de silicium recouvertes de parylène.

7. Formation d’hydrogel sur des réseaux de micropuits

1. Ensemencement de bactéries dans des réseaux de micropuits
   REMARQUE : 700 μL de suspensions cellulaires de 0,1 OD₆₀₀ (densité optique à une longueur d’onde de 600 nm) ont été ensemencés sur les substrats des réseaux de micropuits, et la méthode de décollage du parylène a été appliquée pour retirer les cellules de l’arrière-plan.
2. Préparez la solution de précurseur d’hydrogel en ajoutant 5,6 μL de diacrylate PEG-o-NB avec 12,5 μL de solution saline ATGN tamponnée au phosphate de pH 8 et en mélangeant avec 6,9 μL de la solution de thiol PEG à quatre bras.
3. Pipeter 12,5 μL de la solution précurseur sur une lame de verre perfluoroalkylée non réactive et placer deux entretoises en acier de 38 μm (voir le tableau des matériaux) sur deux côtés opposés du substrat du réseau de micropuits inoculé avec des cellules.
4. Inversez la lame de verre perfluoroalkylé avec la gouttelette de solution précurseur et placez la gouttelette au milieu du substrat du micropuits. Ensuite, incuber pendant 25 min à température ambiante (RT) pour la formation d’hydrogel.
5. Retirez délicatement la lame de verre du substrat du micropuits. La membrane d’hydrogel doit rester attachée au substrat du micropuits.

Résultats

Figure 1 : Conception et fabrication de réseaux de micropuits. (A) Des techniques de microfabrication standard ont été appliquées pour fabriquer des réseaux de micropuits sur plaquettes de silicium. (B

Matériaux